РНК та методи виділення

Більшість досліджень в молекулярній біології застосовують виділені нуклеїнові кислоти для проведення тих чи інших експериментів. При цьому, чистота і якість зразків, наприклад, РНК – вкрай важлива, адже від цього безпосередньо залежить результат дослідження. Існують різні технології і методи виділення РНК, які можуть відрізнятися за принципом дії і типом біологічного матеріалу. У цьому матеріалі зібрали для вас кілька методів виділення РНК, які допоможуть вам у вирішенні ваших завдань.

Здебільшого пробопідготовка до біохімічних і діагностичних досліджень починається з екстракції нуклеїнових кислот. Такі процеси, як, наприклад, ампліфікація методом ПЛР, секвенування, зворотна транскрипція або синтез ДНК проводяться тільки на зразках виділеної і очищеної НК. Отримати максимально якісні та чисті зразки нуклеїнової кислоти для аналізу вкрай важливо, адже домішки білків та інших органічних речовин можуть спотворити результат.

Погане очищення РНК від речовин, які містилися у вихідному біологічному матеріалі, може стати причиною пригнічення реакції під час проведення аналізу методом ПЛР. Ці речовини можуть вплинути на структуру ферменту і суттєво знизити його активність, або і зовсім деактивувати.

Інгібітори можуть опинитися в розчині РНК з кількох причин:

• зразки були погано очищені від органічних речовин в матеріалі, з якого здійснювалася екстракція. Це можуть бути білки, вуглеводи, залишки жирів та пігментів. Якщо нуклеїнові кислоти виділяли з рослинних клітин, інгібіторами в цьому разі можуть бути, наприклад, хлорофіли, антоціани. Також агентами, що затримують реакцію, можуть бути речовини транспортного середовища – формальдегід або гепарин.
• зразки були погано очищені від реагентів, які використовувалися під час виділення нуклеїнової кислоти. Наприклад, від спиртів, денатурантів, сечовини, ПАР.

Цей метод виділення РНК широко використовується через свою відносну дешевизну. Екстракція за цією технологією відбувається в кілька етапів:

1. Отримання лізату. В процесі лізування клітини розщеплюються на фрагменти, які містять частинки клітинної стінки і внутрішньоклітинного вмісту;
2. Інактивація нуклеаз;
3. Виділення необхідної нуклеїнової кислоти.

Перелінковка: Читайте також: Як вибрати діагностичні набори для виявлення РНК SARS-CoV-2 методом ПЛР-РВ

Екстракція НК за допомогою суміші фенол-хлороформу – найстаріший з відомих методів виділення РНК. Фенол повністю денатурує залишки білків в зразку, але при цьому тільки частково інактивує РНКази. Щоб вирішити цю проблему, до фенолу і хлороформу додають ізоаміловий спирт в пропорції 25:24:1, а потім змішують з лізатом і поміщають до центрифуги. В результаті виходить двофазний розчин, в якому всі органічні домішки і білки осідають (гідрофобний шар), а РНК – спливає на поверхню (гідрофільний шар). Далі відбирають верхню фазу, яка містить РНК, додають етанол або ізопропанол в пропорції 2:1 або 1:1, щоб осадити РНК з супернатанта.

Як вже відзначили, перевага цього методу в його відносно невисокій вартості, оскільки не потрібне додаткове обладнання. Однак, отриманий в результаті зразок нуклеїнової кислоти – не дуже високої якості, тому потрібно додаткове очищення.

В основі методу – властивість нуклеїнових кислот за певних умов зв’язуватися з силікатами. Це дає змогу сепарувати компоненти клітини від частинок силіки зі зв’язаними нуклеїновими кислотами. Цю властивість НК було відкрито ще в кінці 1970-х, в результаті чого було розроблено технологію екстракції нуклеїнових кислот на силікатних носіях. Екстракція на спін-колонках – сучасніший і вдосконалений метод виділення нуклеїнових кислот.

Конструкція спін-колонки продумана таким чином, що за нанесення на неї клітинного лізату і подальшого центрифугування, РНК залишається на ній, а решта фрагментів клітини – відсівається. Після цього нуклеїнову кислоту кілька разів промивають, а потім – поміщають в пробірку для забору зразка для дослідження.

Зразок РНК, отриманий в результаті застосування цього методу, відрізняється чистотою і якістю. Але, в порівнянні з попереднім описаним методом, він значно дорожчий.

Для всіх описаних вище способів виділення нуклеїнової кислоти лімітувальним чинником є етап лізису. Для руйнування клітинних стінок у всіх технологіях застосовується додецилсульфат натрію (SDS) і протеіназа К. Справа в тому, що ці речовини – інгібітори, які можуть уповільнювати полімеразну ланцюгову реакцію. Щоб отримати максимально чистий зразок для дослідження, виділену РНК необхідно кілька разів промити, а це, своєю чергою, підвищує ризик контамінації та може зовсім привести до втрати зразка.

Вирішення цієї проблеми знайшли новозеландські вчені. Щоб мінімізувати вплив хімікатів, що використовуються для екстракції нуклеїнової кислоти, на якість зразка, вони вирішили використовувати термофільну протеїназу ЕА1 в поєднанні з мезофільними гідролазами.

Перелінковка: Читайте також: ПЛР-дослідження: типові помилки і як їх уникнути

• Змішують зразок з буфером і ферментами
• Подальша інкубація за кімнатної температури, в процесі якої гідролази руйнують стінки клітин
• Руйнування білків і вивільнення РНК в результаті активації роботи протеїнази ЕА1 шляхом нагрівання пробірки з сумішшю до 75°С

Щоб отримати готовий для подальших досліджень зразок РНК, необхідно деактивувати ЕА1. Для цього пробірку нагрівають до 95°С

На відміну від попередніх методів виділення РНК, ферментативну температурно-залежну екстракцію можна автоматизувати. Використання цієї технології дає змогу отримати високоочищені зразки нуклеїнової кислоти за максимально короткий час – до 7 хвилин.

На сьогоднішній день завдяки швидкості виконання і можливості автоматизації процесу особливою популярністю  користується метод виділення НК на магнітних часточках.

Технологія його основана на зв’язуванні НК з речовиною,яка вкриває магнітні часточки. В зразок що лізується додають магнітні часточки та змішують.Потім фіксують тверду фазу,підносячи пробірки зі зразком до магніту або поставивши їх в магнітний штатив. Потім відбирають супернатант (надосад), а НК промивають та додають розчин для елюції.

Безумовною перевагою цього методу є той факт що для його проведення не є обов’язковою наявність складного устаткування.

Згадані в статті методи виділення РНК – лише незначна частина технологій, застосовуваних сьогодні для екстракції нуклеїнових кислот в процесі пробопідготовки. Крім цього, на ринку є безліч готових рішень, які дозволяють підготувати якісні зразки для аналізу просто “з коробки”. У порівнянні з традиційними методами екстракції НК, використання готових наборів дає змогу значно скоротити час і трудовитрати на підготовку проб, а також виключити можливі помилки через “людський фактор”.