Інструкція з програмування та обробки результатів ПЛР-РЧ для набору діагностичного «Biocore® Синдром Жильбера» для приладу CFX96
Визначення генотипу методом алельної дискримінації дозволяє встановити генотипи зразків автоматично. У приладах CFX та QuantStudio 5 він ґрунтується на аналізі відносної флуоресценції (RFU/∆Rn) між двома каналами (Allele 1 – FAM та Allele 2 – VIC).
Програмування приладу
-
Відкрийте Bio-Rad CFX Dx і створіть новий протокол згідно з інструкцією з використання (ІЗВ) «Biocore® Синдром Жильбера»: File→New→Protocol (Рис. 1)
-
Перейдіть у вікно Plate→Edit Selected та налаштуйте планшет, запрограмувавши необхідні лунки та канали флуоресценції. У вкладці Type Sample оберіть позначки для контрольних зразків «Positive Control» та «NTC» (Рис. 2).
-
Завантажте реакційні стріпи в прилад та запустіть реакцію – START RUN.
Облік результатів
Після відкриття експерименту автоматично відображається вкладка із графіком ампліфікації (Quantification). Перевірте контрольні зразки візуально. Для цього у лінійному типі шкали оцініть криві ампліфікації, де у гомозиготних зразках висота флуоресценції одного з каналів вище за інший, тоді як у гетерозиготних обидві криві проходять на однаковому рівні. В негативних контрольних зразках – сигнал ампліфікації за каналами FAM та VIC відсутній (Рис. 3).
Увага! Якщо у дослідному зразку відсутній сигнал за каналом FAM та/або VIC – результат вважається невалідним і аналіз необхідно повторити, починаючи з етапу екстракції нуклеїнових кислот.
Для автоматичного обліку результатів програмним забезпеченням перейдіть у вкладку дискримінації алелів (Allelic Discrimination). Переконайтеся, що осі X та Y налаштовані відповідно до флуорофорів: X — FAM, Y — VIC.
Перевірте правильність контрольних зразків:
-
контрольний зразок дикого типу має відповідати точці на осі Allele 2 (синій колір);
-
контрольний зразок мутантний алель відповідає точці на осі Allele 1 (оранжевий колір);
-
контрольний зразок гетерозиготи знаходиться посередині (зелений колір);
-
негативний контрольний зразок знаходиться в лівому нижньому куті (чорний колір).
Дослідні зразки відображаються аналогічним чином (Рис. 4).
Якщо при автоматичній обробці даних негативний чи позитивний контрольний зразок оцінено некоректно або зразок відображається як «х» – результат невизначений*, то в панелі налаштувань (Select cycle) оберіть значення ≥35 циклу.
* Можливими причинами отримання невизначеного результату для зразка можуть бути неналежний забір біоматеріалу або помилки під час екстракції нуклеїнових кислот.
-
Якщо після внесення змін до налаштувань зразок став визначеним, обов’язково перевірте отриманий результат візуально за кривими ампліфікації у вікні Quantification.
-
Якщо після виконаних дій результат контрольного зразка досі не відповідає зазначеним вимогам / зразок все ще не визначений, то результат вважається невалідним і потребує повторного проведення.