FAQs

За допомогою набору реагентів Biocore® Nucleo-M можна здійснити екстракцію зі зразків плазми крові, сироватки крові, а також мазків з верхніх та нижніх дихальних шляхів, кон’юнктивального секрету, сперми, секрету простати, зішкрібів з цервікального каналу та уретри, виділеннь піхви, зішкрібів з виразково-ерозивних елементів, калу.

Набори реагентів SpinFood DNA-50 та MagFood DNA-50 призначені для екстракції зразків з рослинного матеріалу, продуктів харчування та харчової сировини рослинного походження.

Виробник рекомендує здійснювати екстракцію нуклеїнових кислот виключно з переліку біоматеріалу, який наведений в інстукції до набору (-ів).

Якщо біоматеріал, що Вас цікавить відсутній в інструкції до набору – Ви можете написати лист-звернення до технічної підтримки ТОВ «Біокор Текнолоджі ЛТД» з розширеним викладенням Вашого запиту.

Набір реагентів Nucleo-М призначений для екстракції тотальної РНК/ДНК. Набори реагентів SpinFood DNA-50 та MagFood DNA-50 призначені для екстракції тотальної ДНК.

Процес екстракції нуклеїнових кислот набором реагентів Nucleo-М триває приблизно 30 хв, наборами SpinFood DNA-50 та MagFood DNA-50 – 50-60 хв.

При використанні набору реагентів Nucleo-М об’єм елюції становить 50 мкл, наборів SpinFood DNA-50/MagFood DNA-50 – 100 мкл.

ДНК виділена за допомогою наборів реагентів Nucleo-М/SpinFood DNA-50/MagFood DNA-50 може зберігатись протягом 8 годин при температурі 0 °С, до 1 тижня при температурі ≤ -18 °С та більш тривале зберігання при температурі -70 °С.

РНК виділена за допомогою набору реагентів Nucleo-М може зберігатись протягом одного тижня при температурі -20 °С та більш тривале зберігання при температурі ≤ -70 °С.

Тест-системи ПЛР-РЧ Біокор Текнолоджі побудовані на основі технології TaqMan, в якій ідентифікація специфічної мішені НК (нуклеїнової кислоти – ДНК/РНК) здійснюється за допомогою двох ПЛР-праймерів та флуоресцентно міченого зонду. Збільшення кількості продуктів ампліфікації під час ПЛР вимірюється як наростання флуоресценції, яке відбувається за рахунок вивільнення флуоресцентної мітки.

Наростання флуоресценції під час ПЛР описують кривою (Рисунок.1), яку ділять на 4 фази: фонова, експоненційного зростання, лінійного росту та плато.

Програмне забезпечення приладів автоматично обчислює порогове (Threshold) та фонове (Baseline) значення флуоресценції, але в деяких випадках при ампліфікації спостерігається високий фоновий рівень флуоресценції або ж неспецифічна форма кривої, тому, для отримання коректних результатів дослідження важливо вірно врахувати фонови сигнал. Ця проблема вирішується налаштуванням Threshold та Baseline в ручному режимі.

Threshold (порогове значення флуоресценції) – це лінія на графіку ампліфікації, до якої флуоресценція вважається фоновою, а після якої – значущою. Вона виставляється вище «фонового шуму» та на рівні 10% від максимального флуоресцентного сигналу у фазі плато, (середина експоненційної фази на лінійному типі ПЛР-кривої). Ct (Cycle /Threshold) – це точка перетину кривої флуоресценції з лінією Threshold. Значення Ct відповідає циклу ампліфікації, на якому ця подія відбулася.

Baseline – це рівень фонової флуоресценції, який спостерігається на початкових циклах ампліфікації, коли вивільнення флуоресцентної мітки ще не викликають помітного збільшення інтенсивності флуоресцентного сигналу.
Якщо коригуванням Threshold та Baseline не вдалося уникнути неспецифічних сигналів – рекомендовано переставити весь цикл дослідження (екстракцію НК та ампліфікацію).

Для стабільної роботи діагностичних наборів ми рекомендуємо зберігати компоненти набору при температурі мінус 18-24 °С, за виключенням ПКЗ, СЗ та розчину (-ів) для розведення СЗ, які зберігаються при температурі плюс 4-8 °С після першого розморожування.

Відхилення значень Efficiency, R2, Slope свідчать про помилку при десятикратних розведеннях СЗ або неточне дозування СЗ/реакційної суміші. В такому випадку рекомендовано зробити нові десятикратні розведення та повторити експеримент.

При відсутності флуоресцентного сигналу ПКЗ/СЗ рекомендовано перевірити всі етапи приготування реакційної суміші, правильного внесення ПКЗ/СЗ та провести повторне дослідження.

При наявності кривих ампліфікації в НКЗ результати всієї постановки вважаються невалідними і потребують повторного проведення дослідження з етапу ампліфікації.

Для ампліфікаційних наборів виробництва ТОВ “Біокор Текнолоджі ЛТД” застосовується автоматичне налаштування порогової лінії кожного каналу детекції для лінійки приладів QuantStudioTM 5 (Applied Biosystems, США), Rotor-Gene Q (Qiagen GmbH, Німеччина), CFX 96TM (Bio-Rad, США).

За необхідності порогову лінію можна виставити в ручному режимі. Для цього необхідно перемістити порогову лінію на початок експоненційної фази у випадку лінійного графіка або посередині експоненційної фази на логарифмічному графіку (Рис. 1).

Базову лінію прилад також налаштовує автоматично. При наявності сильних шумів базову лінію необхідно налаштувати вручну. Для цього необхідно задати кінець базової лінії за 5 циклів до перетину з пороговою лінією, а початок – за 12 циклів від кінця базової лінії.

Діагностичні набори та набори для визначення ГМО валідовано для використання на ампліфікаторах з системою детекції в режимі реального часу: QuantStudioTM 5 (Applied Biosystems, США), Rotor-Gene Q (Qiagen GmbH, Німеччина), CFX 96TM (Bio-Rad, США).

З метою контролю проходження етапу виділення та ампліфікації в діагностичних наборах передбачений внутрішньоклітинний контроль – рибонуклеаза Р (RNase P).

У наборах для визначення генетично модифікованих організмів є наступні внутрішньоклітинні контролі, залежно від рослинного матеріалу:

• ген лектину (Lec) – для сої;
• ген алкогольдегідрогенази (Adh1) – для кукурудзи;
• ген круциферину (Cru) – для ріпаку;
• ген chlDNA – для всіх рослин.

Обов’язковим етапом проведення ПЛР з використанням наборів виробництва ТОВ “Біокор Текнолоджі ЛТД” є приготування реакційної суміші відповідно до кількості досліджуваних зразків, НКЗ, ПКЗ, СЗ тощо. Ми наполегливо рекомендуємо готувати реакційну суміш виходячи з кількості досліджуваних зразків, а не вносити компоненти (ПЛР-РЧ суміш, суміш праймерів та зондів (2х), Taq ДНК-полімеразу, ЗТ-ПЛР-РЧ суміш (4х)) окремо.

Для використання діагностичних наборів виробництва ТОВ “Біокор Текнолоджі ЛТД” екстракцію ДНК/РНК з біологічного матеріалу рекомендовано проводити за допомогою наборів реагентів Biocore® Nucleo-M (CM-NA203-100/500/1000), MagMAX™ Viral / Pathogen NA Isolation Kit (Applied Biosystems™) та NucleoMag® Virus kit RNA/DNA Isolation (MACHEREY-NAGEL).

Для використання тест-систем для дослідження ГМО рекомендовано використовувати набори для виділення геномної ДНК з рослинного матеріалу (Biocore® SpinFood DNA-50, Biocore® MagFood DNA-50).

Проте, не виключено використання інших комерційних наборів призначених для екстракції ДНК/РНК з відповідного біологічного матеріалу.