ПЛР-дослідження: типові помилки та як їх уникнути

Команда «Біокор Текнолоджі» розробляє тест-системи та набори для молекулярної діагностики методом ПЛР, і розповість в цьому матеріалі, на які деталі варто звернути увагу для запобігання хибно позитивним та хибно негативним результатам.

ПЛР є універсальним методом лабораторної діагностики, що дозволяє ідентифікувати навіть не власне вірус або бактерію в біологічному матеріалі, а ділянки їх РНК або ДНК.

Чутливість ПЛР-аналізу наближається до 10-100 копій генетичного матеріалу збудника на реакцію. Для порівняння, якщо людина знаходиться в активній фазі розвитку захворювання, то її біологічний матеріал містить мільйони геномів збудника на мілілітр, що, після виділення нуклеїнової кислоти, буде дорівнювати декільком тисячам копій на реакцію.

У світі, і в Україні зокрема, від початку епідемії COVID-19 точаться дискусії щодо того, наскільки надійною є така методика. Одні джерела свідчать, що помилковим може бути кожен четвертий тест, інші вказують, що кількість хибно позитивних та хибно негативних результатів становить лише кілька відсотків. Враховуючи актуальність теми, розглянемо на прикладі ПЛР для діагностики COVID-19 з яких причин можуть виникати сумнівні або помилкові результати. Переважна частина зазначених аспектів має місце і у випадку з ПЛР-тестуванням інших інфекційних захворювань людини.

Такі збудники, як SARS-CoV-2, здатні вражати значну кількість органів. Для дослідження на COVID-19 зазвичай беруться мазки з горла або носоглотки, де збудник у великій кількості знаходиться обмежений час – на 5-10 день від початку інфікування, далі він спускається нижче — до бронхів та легенів. Тому негативний результат ПЛР-тесту не може виключати факту інфікування пацієнта COVID-19.

З одного боку, ризики отримати хибно негативний результат ПЛР-тесту дещо зростають на 1-7 день від початку інфікування, коли кількість вірусу є малою, а також на 10-30 день, коли, по-перше, COVID-19 вже «пішов» нижче, та, по-друге, в організмі вже присутні в достатній кількості антитіла, і розмноження вірусу більш-менш ефективно стримується імунною системою. З іншого боку, в деяких випадках, ми можемо отримати сумнівно позитивний результат ПЛР-тесту навіть на 60-й день від початку інфікування, коли людина вже перехворіла, але в її біологічному матеріалі все ще можна знайти уламки вірусу. Все вищесказане стосується лише деяких окремих випадків і не має характеру «абсолютної закономірності».

Алгоритм тестування регламентований на державному рівні і, якщо існує обґрунтована підозра на інфікування COVID-19, для уточнення діагнозу можуть проводити ПЛР-аналіз повторно.

Для уникнення хибно позитивних результатів внаслідок контамінації — потрапляння молекул ДНК/РНК із зовнішнього середовища, — клінічний матеріал необхідно відбирати стерильними одноразовими інструментами в одноразові стерильні пробірки згідно з встановленими стандартами МОЗ. Взяття матеріалу мають проводити медичні працівники, які одягнені в засоби індивідуального захисту.

Недостатня кількість біологічного матеріалу може призвести до хибно негативних результатів дослідження. В деяких випадках, цю проблему можна відслідкувати на етапі виділення нуклеїнових кислот або в процесі ампліфікації (за умови використанням в діагностичних наборах для виявлення SARS-CoV-2 внутрішнього контролю, тобто фрагменту геному людини).

Враховуючи можливість розпаду РНК в клінічному матеріалі, терміни зберігання і транспортування повинні бути мінімальними. В ідеальному випадку всі мазки потрібно транспортувати в лабораторію протягом 24-48 годин з моменту взяття у спеціальному транспортному середовищі при температурі плюс 4 °C. Транспорте середовище має містити спеціальні реагенти — муколітики, що забезпечують руйнування слизу, який пригнічує ПЛР. Якщо відсутня можливість своєчасно доставити зразки матеріалів до лабораторії, їх можна заморожувати до мінус 70 °C, використовуючи для цього тверду вуглекислоту — «сухий лід». Зразки можна зберігати в лабораторії протягом тижня при температурі мінус 20 °C, або до місяця при температурі мінус 70 °C. Критичним моментом є кількість заморожувань/розморожувань зразку: чим їх більше, тим менше якість зразку та, внаслідок цього, й чутливість методу в цілому.

В результаті знаходження зразків в транспортному середовищі більше за термін, що рекомендований виробником, відбувається ріст природної бактеріальної мікрофлори, яка зазвичай знаходиться у ротовій порожнині людини, та руйнування молекул вірусної РНК в зразку. За умови використання спеціальних консервантів і стабілізаторів, біоматеріал може зберігатись в температурному діапазоні відповідно до інструкції виробника терміном до місяця.

ПЛР-дослідження не проводиться безпосередньо на біологічних зразках і потребує попередньої пробопідготовки. На цьому етапі велике значення має якість наборів для екстракції нуклеїнових кислот, які мають забезпечити виділення зразка відповідної концентрації та ступеню очищення від домішок, що пригнічують ПЛР. Через неправильний вибір набору також може бути втрачена частина або навіть вся РНК збудника, що може призводити до хибно негативних результатів. Якість та чистоту нуклеїнових кислот можна перевірити за допомогою спеціального аналітичного приладу — спектрофотометра. Він є в багатьох лабораторіях, що здійснюють ПЛР-дослідження.

Виділену зі зразків РНК можна зберігати при температурі мінус 20 °C до тижня. Для більш тривалого зберігання потрібна температура мінус 70 °C. Також можна використати спеціальні реагенти, що стабілізують РНК та попереджують її деградацію (наприклад, DEPC — діетилпірокарбонат).

Процес ампліфікації (збільшення копій ділянок ДНК, що зазвичай містять необхідні фрагменти цільових генів) може включати до 45 циклів, під час кожного з яких кількість копій подвоюється. Він забезпечується реагентами, що входять до діагностичних наборів для виявлення SARS-CoV-2, та приладами, що забезпечують циклічну зміну температур — ампліфікаторами.

Для забезпечення коректних результатів, якість діагностичних наборів є першочерговою вимогою. Також лабораторії повинні проводити процедуру їх верифікації, провівши порівняльні випробування з власними панелями референтних зразків та рішеннями від інших виробників. Набори мають надходити до лабораторій у термобоксах з холодовими блоками та зберігатись при температурі мінус 20 °C. Недотримання умов їх транспортування чи зберігання призводить до пошкодження компонентів наборів, та, внаслідок того, до хибно негативних результатів. Щоб попередити цю помилку, до складу кожного діагностичного набору входить позитивний контрольний зразок, задачею якого є встановлення працездатності реагентів.

Діагностичні набори мають бути сумісними з ампліфікаторами, що використовуються у лабораторії. Реагенти, що входять до складу набору, мічені різними флуоресцентними барвниками. Детекція флуоресцентного сигналу від кожного барвника відбувається в певному діапазоні (на певному «каналі»). Якщо прилад має слабку чутливість по певним флуоресцентним каналам, це може призводити до хибних результатів. Для уникнення помилок працівники лабораторій мають перевіряти справність роботи приладів, а також налаштування параметрів роботи та протоколів ампліфікації.

При недотриманні заходів безпеки в приміщеннях лабораторії можуть накопичуватися продукти ампліфікації. Це призводить до контамінації зразків, і, у загальному підсумку, до хибно позитивних результатів. Для підтвердження відсутності контамінації, кожну серію ПЛР-досліджень потрібно супроводжувати постановкою негативних контрольних зразків, що включені до складу діагностичних наборів для виявлення SARS-CoV-2.

Перехресна контамінація може виникати через потрапляння аерозольних часток від сусіднього зразка, що містить вірусну РНК, під час внесення зразків у ПЛР-суміш. На етапі ампліфікації контамінований зразок видає слабкий позитивний результат, який означає, що у досліджуваній пробі виявлено дуже малу кількість вірусу. Але такий результат також може вказувати, що людину тестували до настання повного одужання і рівень вірусу в її організмі був низьким.

Способи попередження контамінації — використання наконечників з фільтрами, хімічна та ультрафіолетова дезінфекція всіх робочих поверхонь, наявність окремих наборів дозаторів, обладнання, халатів та рукавиць для кожної зони, проведення внутрішньолабораторного і зовнішнього контролів якості досліджень — регламентовані на державному рівні.

Іншими ефективними, проте дороговартісними заходами для запобігання контамінації є автоматизація етапів виділення нуклеїнових кислот і ампліфікації та подвійний контроль – постановка кожного зразка у двох паралельних реакціях.

Розрахунки результатів ПЛР в реальному часі проводяться з використанням комп’ютерних програм. Ампліфікатор в автоматичному режимі вимірює інтенсивність флуоресценції в зразках під час кожного циклу. Крива ампліфікації має так звану фазу експонентного зростання, після якої слідує фаза плато. Автоматична інтерпретація результатів не завжди дає правильний результат, тому рекомендовано проводити аналіз кривих ампліфікації на предмет перетинання порогових значень, та корегувати завдання порогових значень за необхідністю. Для більшої достовірності можна порівняти таку сумнівну криву з кривою підтвердженого позитивного зразка.

На кожному етапі дослідження є умови, недотримання яких може призвести до недостовірних результатів. Деякі з потенційних помилок є загальними для більшості видів лабораторної діагностики (наприклад, помилки під час взяття та зберігання зразка, налаштування обладнання), тоді як інші є специфічними лише для цього виду дослідження (наприклад, контамінація зразків, низька якість виділених нуклеїнових кислот).

ПЛР – багатостадійний метод, і для отримання максимально достовірних та відтворюваних результатів потрібне належне виконання кожного етапу процесу згідно зі стандартами МОЗ та інструкціями виробників. Другою важливою умовою є якість всіх реагентів та розхідних матеріалів, що використовуються в ПЛР: систем для збору біологічних матеріалів, наборів для виділення нуклеїнових кислот, діагностичних наборів для виявлення SARS-CoV-2.