SARS-CoV-2: як відбувається втрата нюху?

Аносмія або втрата нюху – поширений та подекуди єдиний симптом COVID-19. Вона може бути повною або частковою. Група вчених з різних країн спробувала визначити послідовність подій, що ведуть до нюхової дисфункції (див. журнал Cell). Як матеріал для дослідження використовували зразки слизової оболонки органів дихання від 85 пацієнтів, які померли через кілька днів після зараження SARS-CoV-2. Дослідження показали, що саме підтримуючі клітини є основними мішенями SARS-CoV-2, тоді як нюхові нейрони вірус не вражає.

На Рис. 1 показана ​​візуальна схема потрапляння вірусу SARS-CoV-2 в організм людини. Основне місце ураження – дихальний епітелій, у війчастих клітинах якого вірус реплікується. Базальні та келихоподібні клітини при цьому залишаються недоторканими. Дослідивши взяті зразки, вчені не знайшли доказів інфекції нюхових сенсорних нейронів. Паренхіма нюхової цибулини, через яку вірус потрапляє у тканини мозку, також не постраждала. Але вірус був знайдений в оболонках, що її покривають: павутинній та м’якій.

Таким чином, вчені дійшли висновку, що SARS-CoV-2 не є нейротропним вірусом.

Висока температура, кашель, нежить – реакції, що властиві як при ГРВІ, так і при COVID-19. Без тесту розрізнити ці два захворювання практично неможливо. Але є симптоми, наявність яких більше притаманна для коронавірусної інфекції.

Нюхальна дисфункція була виявлена ​​на ранній стадії пандемії COVID-19 та є сильним і практично постійним симптомом. Згідно з дослідженнями у 25% хворих аносмія виявляється першим симптомом. І приблизно у 50% ця ознака виникає по ходу захворювання. На перший погляд, відсутність нюху не є небезпечною, але найчастіше триває досить довго і несе певний дискомфорт. У тому числі може підвищити ймовірність харчового отруєння.

Слизову оболонку порожнини носа формують дві області: дихальна та нюхова.

Епітелій дихальної області вкритий такими клітинами:

• келихоподібні клітини, що відповідають за виділення слизу;
• війчасті клітини, що сприяють ефективному просуванню слизу та секреції патогенів, що потрапили до неї;
• базальні клітини, що відновлюють слизову оболонку.

Далі розміщена базальна мембрана та Lamina propria: власна пластинка.

Нюхальна область представлена ​​невеликими острівцями та значно менша за дихальну. Складається вона з:

• нюхових нейронів;
• підтримуючих клітин;
• базальних клітин.

На Рис. 2 показано як пахучі молекули проникають у порожнину носа і дендрити нюхових нейронів вловлюють їхню присутність. Далі через аксони нюхових нейронів сигнал проходить в нюхову цибулину, де відбувається формування синапсів з мітральними клітинами. А вже через них сигнал потрапляє до первинної нюхової кори, мигдалика та гіпоталамусу. З’являється відчуття запаху, а також виникають реакції та емоції, пов’язані з ним.

Хоча втрата нюху є частою та характерною реакцією при COVID-19, механізм повного розвитку даного симптому все ж таки залишається для вчених загадкою. Один із найбільш очевидних факторів – запальний процес слизової оболонки порожнини носа. Адже SARS-CoV-2 найчастіше проникає в організм через клітини дихального епітелію. Але тут постає питання: що відбувається з нюховим епітелієм? Щоб потрапити в клітину, вірусу потрібна наявність рецептора АСЕ2 та протеази TMPRSS2. Рецептори ACE2 є на поверхні клітин різних органів (сюди належить і центральна нервова система). Беручи це до уваги, вірус, ймовірно, здатний вражати не тільки нюхові нейрони, але й самі клітини нюхової цибулини.

У 2020 році було опубліковано дослідження, де розкривалася тема можливості проникнення SARS-CoV-2 в нюхову систему (Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia). Вдавшись до аналізу опублікованих результатів секвенування РНК окремих клітин нюхового епітелію, вчені виявили, що в основному експресія білка АСЕ2 відбувається в базальних, підтримуючих клітинах та в клітинах, які оточують кровоносні судини. У нейронах експресію АСЕ2 виявлено не було. Подальші супутні дослідження проводилися на мишах, тому щоб підтвердити спостереження щодо SARS-CoV-2 та нейронів, необхідні були експерименти з біопсією заражених пацієнтів. Цей метод використали вчені зі США, Бельгії та Німеччини, за підсумками їх експериментів і опубліковано статтю в журналі Cell. 

Складність полягала в тому, що нюхова цибулина у живої людини важкодоступна і взяття зразка супроводжувалося б руйнуванням решітчастої пластинки решітчастої кістки. Тому для отримання вірогідного результату біопсію потрібно брати post mortem, тобто у померлих пацієнтів. Для цього вченими було розроблено спеціальний протокол, що дозволяв негайно отримати зразки до моменту руйнування клітин.

Після фіксації смерті пацієнта, який дав згоду на участь в експерименті, терміново проводилася біопсія. Для взяття матеріалу використовувалася та сама ендоскопічна система, як і під час операції на черепі. Таким чином було отримано 85 зразків: 68 від померлих від COVID-19, 15 зразків взяли у контрольних пацієнтів та 2 у пацієнтів, які перехворіли на коронавірусну інфекцію, але померли пізніше від інших захворювань.

Перше завдання, яке поставало після отримання зразків, — візуалізувати різні типи клітин у слизових нюхової цибулини та нюхової області. З цією метою було застосовано метод гібридизації РНК, який допоміг розглянути окремі молекули РНК на мікрофотографії. А імуногістохімічне фарбування дало змогу побачити, як розташовані білки.

На Рис. 3 представлений RNAscope та імуногістохімічний аналіз при дослідженні зразків слизової оболонки дихальної та нюхової областей, а також нюхової цибулини. Ми бачимо respiratory mucosa – слизову оболонку дихальної області, olfactory mucosa – слизову оболонку нюхової області та olfactory bulb – нюхову цибулину. Щоб вивчити морфологію зразків, для фарбування використовували гематоксилін та еозин (верхній ряд). У нижньому ряду наведено зображення, які отримали за допомогою конфокального мікроскопа. Білим кольором позначені ядра клітин. Рештою кольорів акцентовано такі маркери:

• у слизовій дихальної області: мРНК гену FOXJ1 (маркер клітин миготливого епітелію, виділений зеленим); білок EPCAM (що належить епітеліальним клітинам, виділений червоним) та білок MUC5AC (що належить келихоподібним клітинам, виділений синім);
• у слизовій нюхової області: мРНК гену OR5A1 (нюховий рецептор, виділений зеленим), мРНК гену OMP (виділений червоним) та білок KRT8 (виділений синім);
• у нюховій цибулині: білок SSTR2A (маркер м’якої та павутинної оболонок головного мозку, виділений зеленим) та білок TUBB3 (експресується в нейронах, виділений синім).

Визначити наявність SARS-CoV-2 у клітинах – друге завдання, яке стояло перед вченими. Вирішили його також за допомогою RNAscope. З 68 пацієнтів у 30 було виявлено вірус. Усі випадки, крім одного, “інформативні”: пацієнтам було діагностовано COVID-19 за 16 днів до смерті. У слизовій дихальної області вірус спостерігався у війчастих клітинах і, в окремих випадках, у клітинах, що вистилають протоки залоз слизової оболонки. А у трьох випадках це були єдині клітини з вірусом.

Загальна картина розподілу SARS-CoV-2 у слизовій оболонці дихальної області померлих від COVID-19 представлена ​​на Рис. 4. 

Вірус SARS-CoV-2 було виявлено у слизовій оболонці в 6 “інформативних” випадках. Для детального вивчення розподілу вірусу вчені використовували різні маркери нюхових нейронів: мРНК ANO2, CNGA2, GNAL, GNG13, OMP, гени нюхових рецепторів і білок TUBB3.

Особливо інформативні дані було отримано від пацієнта №8, який помер від COVID-19 через чотири дні після підтвердження захворювання. У взятих зразках було зафіксовано відсутність слідів нуклеокапсидного білка. Він був присутній в основному в підтримуючих клітинах (Рис. 5, D, E), які експресують маркерами ERMN та UGT2A1. SARS-CoV-2 знижує рівень транскрипції та трансляції клітин, тому інтенсивність сигналу в заражених клітинах нижча. Як приклад, на Рис. 5, F: підтримуюча клітина заповнена сигналом від нуклеокапсидного білка вірусу та РНК SARS-CoV-2-orf1ab-sense, при цьому в ній немає характерного для підтримуючих клітин сигналу від мРНК GPX3 (глутатіон пероксидази).

У нюхових нейронах ознаки вірусу виявлено не було. На Рис.5, G-I спостерігається присутність у зовнішньому шарі сигналу від вірусних РНК, який збігається з клітинами, де відбувається експресія білка KRT8. Нижній шар клітин, що відповідає мРНК нюхових рецепторів, розташовується нижче і не збігається із сигналом від вірусної РНК. Для підтвердження дослідження було проведено аналіз біопсії ще двох пацієнтів. Результати показали, що SARS-CoV-2 не інфікує нюхових нейронів.

Також досліджували зразки нюхової цибулини. Як маркери були використані мРНК PECAM1 та два білки SSTR2A та TUBB3. У ході дослідження вірус все ж таки був виявлений (11 випадків з 30), але уражалася лише м’яка оболонка головного мозку та вистилка судин. Паренхіма нюхової цибулини не ушкоджувалася (Рис. 6).

Провівши дослідження, автори дійшли висновку, що SARS-CoV-2 не вражає нюхові нейрони, а основна його мішень – підтримуючі клітини нюхової області. І якщо врахувати той факт, що дані клітини виконують багато функцій (у тому числі й не вивчені), їх пошкодження може призводити до порушення роботи нейронів.

Нездатність SARS-CoV-2 заражати нейрони все ж таки досить складне та спірне питання, оскільки існує низка інших наукових праць, що вивчають питання проникнення вірусу в нервову тканину. Наприклад, дослідження біологів з Америки (Neuroinvasion of SARS-CoV-2 in human and mouse brain).

Якщо вірус вражає підтримуючі клітини, то як це впливає на нейрони? І чи потрапляє вірус у головний мозок через них? Ряд питань все ж таки залишається відкритим і вимагає подальшого вивчення.