Витяг з доповіді Біокор Текнолоджі на Симпозіумі IBTRS 2022
# 277. Розробка діагностикуму для детекції коінфекції «флурона» (одночасного зараження грипом і коронавірусом) методом ПЛР в режимі реального часу та його апробація
Облап Р., Іщенко Л., Пігіда Д., Саютін О.
ТОВ Біокор Текнолоджі ЛТД.
Національний університет біоресурсів та природокористування України.
Вступ. Наприкінці 2021 року з початком нового сезону грипу зросла кількість випадків коінфекції вірусом грипу та коронавірусом, яка отримала назву «флурона». Діагностувати її без лабораторних досліджень практично неможливо, оскільки клінічна картина характерна для обох інфекцій. При «флуроні» можуть посилювати симптоми та ускладнюватися перебіг захворювання, а наслідки можуть бути досить важкими, особливо у груп підвищеного ризику. Виявлення інфікованих «флороною» людей є важливим для розуміння подальшої стратегії лікування та поводження із хворими.
Метою роботи була розробка мультиплексної тест-системи для одночасної детекції збудників грипу А (IAV) і коронавірусу SARS-CoV-2 на основі технології TaqMan методу ПЛР в реальному часі.
Методи. Для конструювання праймерів використовували сегмент геному М вірусу IAV, що кодує матриксний мембранний білок М1, який входить до складу вірусної оболонки; ген ORF1ab, що кодує багатофункціональний полі протеїн вірусу SARS-CoV-2, а також ген RNase P людини, в якості ендогенного контролю. Реакцію ампліфікації проводили в реакційній суміші об’ємом 20 мкл, яка включала: 1х TaqPath™ 1- Step Multiplex Master Mix (Thermo Fisher Scientific), 0,5-0,25 мкМ прямого і зворотнього праймерів, 0,25-0,125 мкМ флуоресцентних зондів мічених барвниками FAM, VIC і JUN. Ампліфікацію проводили із наступним температурним профілем: 25 °С – 2 хв., 53 °С – 10 хв., 95 °С – 2 хв , та 40 циклів (95 °С – 5 сек., 60 °С – 30 сек.)
Результати. Для дослідження валідаційних показників тест-системи використовували сертифіковану референсну панель NATtrol™ Respiratory Verification Panel 2 (ZeptoMetrix) та рекомбінантну плазмідну ДНК, яка містила специфічні ділянки вірусних генів. Специфічність праймерів для ідентифікації IAV і SARS-CoV-2 була перевірена на 20 зразках вірусних, бактеріальних і грибкових патогенів, які пов’язані з розвитком гострих респіраторних захворювань у людини. Встановлено відсутність хибно-позитивних, хибно-негативних результатів та неспецифічних реакцій зі сторонніми організмами. Чутливість розробленої тест-системи визначали шляхом постановки серії десятикратних розведень плазмідної ДНК. Було встановлено, що межа детектування діагностикуму становить близько 10 копій на реакцію, аналітична чутливість – 1.0 x 10³ ГЕ/мл.
Висновок. Отримані результати свідчать, що розроблена тест-система має високу специфічність та чутливість і після проведення відповідних клінічних випробувань може бути рекомендована у комплексних заходах по забезпеченню контролю за епідеміологічною ситуацією в країні.
Ключові слова: вірус грипу А, коронавірус SARS-CoV-2, флурона, ПЛР у реальному часі.
Читайте також Набір діагностичний «Biocore® SARS-CoV-2 Mutation Panel»