Як вибрати діагностичні набори для виявлення РНК SARS-CoV-2 методом ПЛР-РЧ?

Основним принципом здійснення закупівель є максимальна економія та ефективність, тому часто головним критерієм оцінки тендерних пропозицій виступає ціна. В основі роботи всіх діагностичних наборів, призначених для ПЛР-діагностики COVID-19, лежить детекція РНК вірусу SARS-CoV-2. В той самий час, вони можуть відрізнятися характеристиками, що матимуть суттєве значення для вашої лабораторії. В цьому матеріалі розглянемо, на які критерії та особливості слід звернути увагу під час вибору ПЛР-тест-системи.

Ампліфікатори, що використовують у лабораторії, мають бути сумісними з діагностичними наборами за параметрами кількості та чутливості каналів детекції, а також за температурними умовами. Виробники діагностичних наборів вказують в інструкції інформацію щодо торговельних марок та моделей обладнання для ПЛР, під роботу з якими адаптована тест-система. Менша кількість каналів детекції чи відсутність певних барвників унеможливлює використання деяких наборів реагентів. Слабка чутливість приладів за певними флуоресцентними каналами може призводити до хибних результатів досліджень.

Деякі виробники діагностичних наборів вказують обов’язковою умовою використання набору для екстракції РНК з біологічного матеріалу власної торгової марки. Відсутність замінників, своєю чергою, ставить лабораторію-замовника у залежність від наявності, ціни, строків та умов постачання продукції. Якщо інструкцією дозволяється застосувати будь-які комерційні набори для виділення РНК, ймовірність того, що вам доведеться стикнутися з проблемою дефіциту на ринку значно менша.

Набори реагентів повинні відповідати Технічному регламенту щодо медичних виробів для діагностики in vitro (постанова КМУ №754 від 2 жовтня 2013 року). Кожна виготовлена партія має сертифікат якості, що підтверджує її відповідність нормативним документам.

Звертайте увагу на наявність сертифікації виробника діагностичних наборів згідно ISO 13485:2016. Сертифікати гарантують дотримання заявлених стандартів з виготовлення продукції незалежно від зміни зовнішніх або внутрішніх умов. Варто також уточнювати у виробника інформацію щодо країни походження реагентів.

Діагностичні набори можуть мати одно- або двостадійний формат. Одностадійний формат передбачає проведення зворотної транскрипції і ПЛР в одній реакційній суміші. Це сприяє істотному зниженню ймовірності помилок лаборанта та зводить до мінімуму можливість крос-контамінації. За умови використання двостадійного формату, реакції зворотної транскрипції та ПЛР проходять у двох окремих ємностях, і зазвичай, це потребує більше часу. Варто звернути увагу, що компоненти для постановки реакції зворотної транскрипції можуть не входити в діагностичний набір, і їх буде потрібно закупляти окремо в інших виробників.

Праймери, зонди, ферменти, полімераза, буфери та інші компоненти діагностичного набору можуть міститися в різній кількості ємностей. Використання протоколів, за умови яких потрібно змішати вміст лише двох пробірок та додати суміш до досліджуваного зразка, знижує ймовірність помилки лаборанта, дозволяє не витрачати час на додаткові процедури та вимагає менше витратних матеріалів.

Процес ампліфікації при використанні наборів одностадійного формату займає 40-60 хвилин, двостадійного — до 90 хвилин. Хоча різниця нібито й невелика, ці пів години можуть відігравати значну роль в умовах посиленої завантаженості. Час ампліфікації також залежатиме від приладів, що використовуються у вашій лабораторії. Загальний час проведення дослідження з використанням наборів доступних цінових категорій може складати від 2,5 до 4 годин.

Аналітична чутливість або межа детектування — це мінімальна кількість копій специфічної РНК/ДНК, яку набір виявляє в 100% тестувань. В більшості наборів межа детектування становить близько 10-100 копій на реакцію.

Діагностична специфічність — це здатність набору диференціювати РНК вірусу SARS-CoV-2 від РНК/ДНК інших інфекційних агентів. Переважна частина виробників вказує специфічність на рівні 99-100%.

Перед прийняття рішення щодо використання наборів, лабораторії варто здійснити процедуру верифікації шляхом порівняльних випробувань з власною панеллю референтних зразків та інших комерційних наборів.

Для розробки діагностичних наборів ВООЗ рекомендовано висококонсервативні послідовності нуклеотидів, тобто такі, що з найменшою вірогідністю можуть зазнати мутацій. Використання виробником двох чи трьох таких генів-мішеней також зменшує ймовірність отримання хибно негативних результатів.

Зазвичай діагностичні набори містять позитивний і негативний контрольні зразки. Задачею позитивного контролю є встановлення працездатності реагентів, що входять до складу набору, на всіх стадіях реакції. Негативний контроль необхідний для перевірки компонентів реакції на відсутність серед них специфічних і неспецифічних молекул ДНК/РНК, котрі могли потрапити із зовнішнього середовища.

Для зручності детекції та контролю ефективності ампліфікації набір може включати ще й внутрішні контрольні зразки, які можуть бути двох видів — екзогенні та ендогенні. Екзогенний внутрішній контроль — це штучно сконструйований препарат ДНК або РНК, що додається на етапі екстракції нуклеїнових кислот і в процесі ампліфікації вказує на можливі інгібітори реакції. В якості ендогенного внутрішнього контролю використовується фрагмент геному людини, захищений від дії нуклеаз. Разом з мішенями він проходить всі етапи лабораторного дослідження і дає власний флуоресцентний сигнал. Якщо клінічний матеріал неправильно зібрали чи зберігали, тест, що містить ендогенний внутрішній контроль, це покаже.

З метою спрощення і прискорення етапу інтерпретації результатів деякі виробники діагностичних наборів реагентів розробляють спеціальне програмне забезпечення. Зазвичай, воно дозволяє аналізувати в автоматичному режимі графіки кривих по кожному окремому дослідженню та створювати інформаційні звіти щодо всієї серії експериментів.

Більшість наборів мають строк придатності 6-12 місяців при температурі мінус 20 °С. Рідше ПЛР-тест-системи можуть транспортуватись та зберігатись в температурному режимі від +2 до +8 °C. У випадку, коли компоненти набору містяться у 3-6 пробірках, реагенти можуть зберігатися за різних температур, що може створювати додаткові складнощі для лаборанта.

В умовах значної завантаженості лабораторій, важливою є зручність та доступність взаємодії з виробником діагностичних наборів чи дилером, що здійснює технічну підтримку. Вибираючи тест-системи, звертайте увагу на наявність «гарячої лінії», можливості консультації телефоном чи електронною поштою, спроможностей провести інструктаж на робочих місцях. Проблеми з технічною підтримкою можуть призвести до кількох днів простою лабораторії.

Ціна, без сумніву, є важливий критерієм вибору діагностичних наборів для виявлення РНК SARS-CoV-2. Проте, в умовах пандемії, коли лабораторії працюють на граничній потужності, важливими стають такі фактори, як економія часу, зниження ймовірностей помилок лаборанта та отримання сумнівних результатів дослідження, зменшення кількості витратних матеріалів. Оптимально підібраний діагностичний набір може допомогти у вирішенні всіх цих задач.