Значення порогу циклу в ПЛР-аналізі на COVID-19

ПЛР-тестування стало ключовим для стримування пандемії COVID-19, адже воно допомагає виявити тих осіб, які заражені на момент взяття біологічного матеріалу. Велика кількість країн запровадила підхід, що передбачав значний акцент на тестуванні, ізоляції інфікованих та відстеженні їхніх контактів. Це дозволило «придбати час» для систем охорони здоров’я, щоб справлятися зі значною кількістю пацієнтів. З появою вакцин дедалі більше науковців та дослідників прагнуть змістити акцент тестування в сторону інформативності для ведення пацієнта. У статті розкажемо, які кроки вже зроблено у цьому напрямку.

Для діагностики COVID-19 проводять якісні ПЛР-дослідження, їхні результати визначаються в ключі «позитивний»/«негативний» або «виявлено»/«не виявлено». Однак сам по собі метод ПЛР у режимі реального часу дозволяє цикл за циклом стежити за накопиченням ампліфікованої ДНК, доки концентрація не досягне такого значення, яке можна виявити. Кількість циклів, необхідних для виявлення інфекційного агента, відома як поріг циклу (Ct). Існує обернена кореляція між значенням Ct та кількістю вірусного генетичного матеріалу, який був присутній у зразку. Враховуючи, що на кожному циклі ампліфікації кількість вірусного генетичного матеріалу подвоюється, різниця в кількості накопиченого продукту реакції на 10 циклі та на 35 циклі складатиме десятки мільйонів разів. Тобто, нижча величина порогу циклу вказує на більшу кількість цільової нуклеїнової кислоти у зразку.

Граничне значення Ct для якісного тестування визначається виробником діагностичних наборів. Воно може відрізнятись в залежності від того, як зроблений діагностикум і який фрагмент генетичного матеріалу SARS-CoV-2 використаний у якості мішені. Наприклад, зразок із Ct = 36 може оцінюватись як позитивний для набору одного виробника, але вважатиметься негативним або сумнівним для іншого. Для багатьох тестів для діагностики COVID-19 максимально застосовують 40 циклів ампліфікації, проте на ринку є діагностичні набори, для яких граничне значення Ct може становити від 33 до 45 циклів.

Останнім часом ведеться активне обговорення щодо можливості інтерпретації значень Ct для допомоги клініцистам у догляді за пацієнтами з COVID-19. Науковці звертають увагу на проведення досліджень щодо пов’язаності значення Ct з ймовірністю важкого перебігу захворювання, здатністю поширювати інфекцію, надходженням пацієнта до відділення інтенсивної терапії, тривалістю його перебування у лікарні та ризиком летальних випадків. На даний час докази ще недостатньо вагомі, щоб остаточно підтвердити такі гіпотези.

ВООЗ у своїх інформаційних повідомленнях закликає до ретельної інтерпретації слабких позитивних результатів ПЛР-тестування та рекомендує надавати значення Ct постачальникам медичних послуг, якщо вони звертаються із таким запитом. Управління громадського здоров’я Англії (Public Health England) вже розробило керівництво щодо тлумачення та використання значення порогу циклу. На думку експертів Управління громадського здоров’я Англії інтерпретація значень Ct для встановлення перебігу захворювання, його прогнозування або використання у якості показника одужання пацієнта повинна проводитися з урахуванням клінічного контексту. Згідно з настановами канадського Управління громадського здоров’я Онтаріо (Public Health Ontario) з листопада 2020 року значення Ct від 35 до 38 вказуються в лабораторному звіті, а в інших випадках вони доступні для медичних працівників за запитом. В цьому урядовому агентстві також працюють спеціалісти, яким лікарі можуть поставити будь-які запитання щодо інтерпретації лабораторних результатів або ведення окремих складних випадків. Спеціалізоване агентство Ірландії з нагляду за інфекційними хворобами Health Protection Surveillance Centre розробило керівництво щодо прийняття клінічних рішень для безсимптомних осіб, які отримали слабкі позитивні результати ПЛР. Американський Центр контролю та профілактики захворювань (Centers for Disease Control and Prevention) закликає до обережності під час інтерпретації значення порогу циклу. CDC вважає кореляцію між значеннями Ct та кількістю вірусу у вихідному зразку недосконалою, і тому, на думку агентства, проблематично зробити висновок про будь-який зв’язок між цим показником в окремого пацієнта та його вірусним навантаженням. МОЗ України поки не надавало жодних настанов або застережень щодо звітування про значення порогу циклу та його використання у клінічній практиці.

Варто враховувати, що значення Ct залежить від низки зовнішніх факторів. SARS-CoV-2 здатен вражати значну кількість органів, тому різні мазки від однієї людини можуть дати різні результати. Значення порогу циклу може також змінюватися протягом перебігу хвороби. Час взяття біологічного матеріалу також відіграє важливу роль — зразки, зібрані в перші дні появи симптомів, зазвичай, матимуть нижчі значення Ct, ніж ті, що були зібрані пізніше під час хвороби. В перші дні після появи симптомів більша ймовірність виявити вірус у мазках з горла або носоглотки, на 5-10 день від початку інфікування збудник COVID-19 спускається до бронхів та легень. Значення Ct може змінюватися зі збільшенням витрат часу на транспортування та в залежності від умов зберігання зразків. Має значення і якість зразка, адже наявність домішок, що пригнічують ПЛР, знижує ефективність реакції, впливаючи як на значення Ct, так і на кінцеві результати дослідження. Виробники діагностичних наборів для виявлення SARS-CoV-2 використовують різні гени-мішені геному коронавірусу, а отже й різні комбінації праймерів для пошуку цих мішеней. Межі детекції діагностичних наборів також відрізняються. Невідповідність між ампліфікаторами може ставати причиною для варіабельності значень Ct навіть при тестуванні одного і того ж зразка. Деякі прилади не дозволяють спостерігати реакцію в режимі реального часу, а результат дослідження одразу інтерпретується програмним забезпеченням як «позитивний» або «негативний».

Рекомендації щодо інтерпретації ПЛР-аналізу та клінічної корисності значень Ct можуть змінюватись у міру розвитку наукових знань про COVID-19. Для достовірності результатів ПЛР-тестування потрібно дотримуватись інструкцій виробників наборів реагентів та витратних матеріалів. Перш ніж використовувати набір для тестування зразків пацієнтів, лабораторіям варто проводити їхню ретельну внутрішню оцінку на панелі відомих позитивних та негативних зразках SARS-CoV-2, щоб переконатися, що набір працює належним чином.